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      培養基制備技術

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      一、玻璃器皿的清洗

      在制備培養基的過程中,首先要使用一些玻璃器皿,如試管、三角瓶、培養皿、燒杯和吸管等。這些器皿在使用前都要根據不同的情況,經過一定的處理,洗刷干凈。有的還要進行包裝,經過滅菌等準備就緒后,才能使用。

      1、新購的玻璃器皿

      除去包裝沾染的污垢后,先用熱肥皂水刷洗,流水沖凈,再浸泡于1~2%的工業鹽酸中數小時,使游離的堿性物質除去,再以流水沖凈。對容量較大的器皿,如大燒瓶、量筒等,洗凈后注入濃鹽酸少許,轉動容器使其內部表面均沾有鹽酸,數分鐘后傾去鹽酸,再以流水沖凈,倒置于洗滌架上將水空干,即可使用。

      2、用過的玻璃器皿

      凡確無病原菌或未被帶菌物污染的器皿,使用后可隨時沖洗,吸取過化學試劑的吸管,可先浸泡于清水中,待到一定數量后再集中進行清洗。有可能被病原菌污染的器皿,必須經過適當消毒后,將污垢除去,用皂液洗刷,再用流水沖洗干凈。若用皂液未能洗凈的器皿,可用洗液浸泡適當時間后再用清水洗凈。洗液的主要成份是重鉻酸鉀和濃流酸,其作用是將有機物氧化成可溶性物質,以便沖洗。洗液有很強的腐蝕作用,使用時應特別小心,避免濺到衣服、身體和其他物品上。

      二、培養基的類型

      在實驗室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產物的任何營養基質,都叫做培養基(Media)。由于各類微生物對營養的要求不同,培養目的和檢測需要不同,因而培養基的種類很多。我們可根據某種標準,將種類繁多的培養基劃分為若干類型。

      1、根據對培養基組成物質的化學成分是否完全了解來區分,可以將培養基分為天然培養基、合成培養基和半合成培養基。

      1)天然培養基 天然培養基是指利用各種動、植物或微生物的原料,其成分難以確切知道。用作這種培養基的主要原料有:牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。用這些物質配成的培養基雖然不能確切知道它的化學成分,但一般來講,營養是比較豐富的,微生物生長旺盛,而且來源廣泛,配制方便,所以較為常用,尤其適合于配制實驗室常用的培養基。這種培養基的穩定性常受生產廠或批號等因素的影響。

      2)合成培養基 合成培養基是一類化學成分和數量完全知道的培養基,它是用已知化學成分的化學藥品配制而成。這類培養基化學成分精確、重復性強,但價格昂貴,而微生物又生長緩慢,所以它只適用于做一些科學研究,例如營養、代謝的研究。

      3)半合成培養基 在合成培養基中,加入某種或幾種天然成分;或者在天然培養基中,加入一種或幾種已知成分的化學藥品即成半合成培養基。例如馬鈴薯蔗糖培養基等。這種培養基在生產實踐和實驗室中使用最多。

      2、根據培養基的物理狀態來區分,可以分為固體培養基、液體培養基和半固體培養基。

      1)液體培養基 所配制的培養基是液態的,其中的成分基本上溶于水,沒有明顯的固形物,液體培養基營養成分分布均勻,易于控制微生物的生長代謝狀態。

      2)固體培養基 在液體培養基中加入適量的凝固劑即成固體培養基。常用作凝固劑的物質有瓊脂、明膠、硅膠等,以瓊脂最為常用。固體培養基在實際中用得十分廣泛。在實驗室中,它被用作微生物的分離、鑒定、檢驗雜菌、計數、保藏、生物測定等。

      3)半固體培養基 如果把少量的凝固劑加入到液體培養基中,就制成了半固體培養基。以瓊脂為例,它的用量在0.2~1%之間。這種培養基有時可用來觀察微生物的動力,有時用來保藏菌種。

      3、根據培養基的用途來區分,可分為選擇培養基、增殖培養基、鑒別培養基等。

      1)選擇培養基 在培養基中加入某種物質以殺死或抑制不需要的菌種生長的培養基,稱之為選擇培養基。如鏈霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生長;而制霉菌素、灰黃霉素等能抑制真核微生物的生長;結晶紫能抑制革蘭氏陽性細菌的生長等。

      2)增殖培養基 在自然界中,不同種的微生物常生活在一起,為了分離我們所需要的微生物,在普通培養基中加入一些某種微生物特別喜歡的營養物質,以增加這種微生物的繁殖速度,逐漸淘汰其它微生物,這種培養基稱為增殖培養基,這種培養基常用于菌種篩選和選擇增菌中。在某種程度上講,增殖培養基也是一種選擇培養基。

      3)鑒別培養基 在培養基中加入某種試劑或化學藥品,使難以區分的微生物經培養后呈現出明顯差別,因而有助開快速鑒別某種微生物。這樣的培養基稱之為鑒別培養基。例如用以檢查飲水和乳品中是否含有腸道致病菌的伊紅美藍培養基就是一種常用的鑒別性培養基。

      有些培養基是具有選擇和鑒別雙重作用。例如食品檢驗中常用的麥康凱培養基是一例。它含有膽鹽、乳糖和中性紅。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細菌的作用(選擇性),乳糖和中性紅(指示劑)能幫助區別乳糖發酵腸道菌(如大腸桿菌)和不能發酵乳糖的腸道致病菌(如沙門氏菌和志賀氏菌)。

      另外,根據培養基的營養成分是否“完全”,可以分為基本培養基、完全培養基和補充培養基,這類術語主要是用在微生物遺傳學中。根據培養基用于生產的目的來區分,可以分為種子培養基和發酵培養基。還有專門用于培養病毒等寄生微生物的活組織培養基,如雞胚等;專門用于培養自養微生物的無機鹽培養基等。

      三、培養基制備的基本方法和注意事項

      1、培養基配方的選定

      同一種培養基的配方在不同著作中常會有某些差別。因此,除所用的是標準方法,應嚴格按其規定進行配制外,一般均應盡量收集有關資料,加以比較核對,再依據自己的使用目的,加以選用,記錄其來源。

      2、培養基的制備記錄

      每次制備培養基均應有記錄,包括培養基名稱,配方及其來源,和各種成份的牌號,最終pH值、消毒的溫度和時間制備的日期和制備者等,記錄應復制一份,原記錄保存備查,復制記錄隨制好的培養基一同存放、以防發生混亂。

      3、培養基成分的稱取

      培養基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂,最好一次完成,不要中斷??蓪⑴浞街糜诎鴤?,每稱完一種成分即在配方面軍做出記號,并將所需稱取的藥品一次取齊,置于左側,每種稱取完畢后,即移放于右側。完全稱取完畢后,還應進行一次檢查。

      4、培養基各成份的混合和溶化

      培養基所用化學藥品均應是化學純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋,以防有微量銅或鐵混入培養基中,使細菌不易生長。最好使用不銹鋼萵加熱溶化,可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時、可先用溫水加熱并隨時擾動、以防焦化、如發現有焦化現象、該培養基即不能使用,應重新制備。待大部分固體成分溶化后,再用較小火力使所有成分完全溶化,迄至煮沸。如為瓊脂溶化,用另一部分水溶化其它成分,然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中,因蒸發而丟失的水分,最后必須加以補足。

      5、培養基pH的初步調正

      因培養基在加熱消毒過程中、pH會有所變化,培養基各成分完全溶解后,應進行PH的初步調正。例如,牛肉浸液約可降低pH0.2,而腸浸液pH卻會有顯著的升高。因此,對這個步驟,操作者應隨時注意探索經驗、以期能掌握培養基的最終PH,保證培養基的質量。PH調整后,還應將培養基煮沸數分鐘,以利培養基沉淀物的析出。

      6、培養基的過濾澄清

      液體培養基必須絕對澄清,瓊脂培養基也應透明無顯著沉淀,因此,須要采用過濾或其它澄清方法以達到此項要求。一般液體培養基可用濾紙過濾法,濾紙應折疊成折扇或漏斗形,以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。

      瓊脂培養基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去,再用濾紙反復過濾。如過濾法不能達到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至55~60°C的培養基放入大的三角燒瓶內,裝入量不得超過燒瓶容量的1/2,每1000ml培養基加入1~2個雞蛋的蛋白,強力振搖3~5分鐘,置高壓蒸汽滅菌器中、121°C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。

      7、培養基的分裝

      培養基的分裝,應按使用的目的和要求,分裝于試管、燒瓶等適當容器內。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵,其外還須用防水紙包扎(現試管一般多有用螺旋蓋者)。分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養基時,分裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當。分裝容器應預先清洗干凈并經干烤消毒,以利于培養基的徹底滅菌。每批培養基應另外分裝20ml培養基于一小玻璃瓶中,隨該批培養基同時滅菌,以為測定該批培養基最終pH之用。

      8、培養基的滅菌

      一般培養基可采用121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養基制備方法中,如無特殊規定,即可用此法滅菌。

      某些畏熱成分,如糖類,應另行配成20%或更高的濃液,以過濾或間歇滅菌法消毒,以后再用無菌操作技術、定量加于培養基。明膠培養基亦應用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應以無菌操作技術抽取和加入于經冷卻約50°C左右的培養基中。

      瓊脂斜面培養基應在滅菌后立即取出,冷至55℃-60℃時,擺置成適當斜面,待其自然凝固。

      9、培養基的質量測試

      每批培養基制備好以后,應仔細檢查一遍,如發現破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養基沾染等、均應挑出棄去。并測定其最終pH。

      將全部培養基放入36±1°C恒溫箱培養過夜,如發現有菌生長,即棄去。

      用有關的標準菌株接種1~2管或瓶培養基,培養24~48小時,如無菌生長或生長不好。應追查原因并重復接種一次,如結果仍同前,則該批培養基即應棄去,不能使用。

      10、培養基的保存

      培養基應存放于冷暗處,最好能放于普通冰箱內。放置時間不宜超過一周,傾注的平板培養基不宜超過3天。每批培養基均必須附有該批培養基制備記錄副頁或明顯標簽。

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